Análisis de MAGs

Objetivos

El objetivo de este taller es realizar el ensamblaje y análisis de calidad de metagenomas, así como la predicción de genes y su anotación funcional de dos muestras metagenómicas de pacientes con VIH y sin VIH. De este modo se espera que el estudiante sea capaz de aprender sobre las principales herramientas bioinformáticas para el análisis de metagenomas y su aplicación en la investigación. Consulte la presentación en este link.

Para este taller se usaran muestras de metagenomas de pacientes con VIH y sin VIH. Los datos de secuenciación están disponibles en el directorio ~/Datasets/Taller6. Los archivos son:

Archivo Descripción
SRR13452514_1.f10.fastq.gz Muestra forward control al 10% (Q_C3)
SRR13452514_2.f10.fastq.gz Muestra reverse control al 10% (Q_C3)
SRR13452521_1.f10.fastq.gz Muestra forward caso al 10% (Q_H1)
SRR13452521_2.f10.fastq.gz Muestra forward caso al 10% (Q_H1)

Note que estos fueron submuestreados al 10% para facilitar el análisis usando rasusa:

rasusa -i <samplereads>.fastq.gz -f 0.1 -o <samplereads>.f10.fastq.gz

I. Ensamble y análisis de calidad de MAGs (50/100)

  1. Realice el ensamble de las muestras metagenómicas (control y caso) con los parámetros por defecto para librerías pareadas usando el software megahit. ¿Cuáles son los parámetros por defecto del programa? ¿Que parámetros considera que sería útil modificar? Justifique su respuesta.
Importante

Recuerde activar el ambiente adecuado: conda activate megahit

megahit -1 <forwardreads>.f10.fastq.gz -2 <reversereads>.f10.fastq.gz -o control
Bono

Realice el ensamble con los parámetros por defecto y con los parámetros que usted considera útiles modificar. Compare los resultados y justifique su elección. Luego realice el ensamble usando otro ensamblador como SPAdes en modo metagenómico. Compare los resultados obtenidos con los de megahit. ¿Cuál ensamblador considera que es mejor para este tipo de datos? Justifique su respuesta1.

  1. Utilice QUAST v5.0.2 para revisar los estadísticos del ensamblaje. Genere y muestre el reporte. Responda ¿Qué le indican la longitud total, el número de contigs totales, el número de contigs, y las métricas de N50 y L50? Revise la siguiente discusión y explique.

Una manera rápida de calcular las estadísticas sin el reporte visual es usando seqfu:

seqfu stats -n SRR13452514_1.f10.fastq.gz
File #Seq Total bp Avg N50 N75 N90 auN Min Max
SRR13452514_1.f10.fastq.gz 4154060 627263060 151.00 151 151 151 0.00 151 151
  1. Según esto ¿Qué tan bien cree que se realizó el ensamblaje? de las dos muestras metagonómicas, cuál cree que tiene mejor calidad? Justifique su respuesta.

II. Predicción de genes y análisis funcional (50/100)

Predicción de genes: La predicción de genes es la identificación algorítmica de segmentos de secuencias que son biológicamente funcionales, como los genes codificantes de proteínas, genes codificadores de ARN (e.g, 16S rARN) y secuencias reguladoras. Una vez ensamblado el genoma o el metagenoma, vamos a llevar a cabo la predicción de genes mediante el software Bakta.

  1. Ejecute bakta sobre cada ensamble (control y caso) realizado según la sección elegida al inicio del taller. Para esto utilice:
Importante

Recuerde activar el ambiente adecuado: conda activate bakta-1.9.3

bakta --threads 8\
 --prefix <prefix>\
 --db ~/.dbs/bakta-db/db-full\
 --output <outdir>\
 --meta\
 --skip-trna\
 --skip-tmrna\
 --skip-rrna \
 --skip-ncrna\
 --skip-ncrna-region\
 --skip-crispr\
 <contigs>.fasta
1
Skip tRNA detection & annotation
2
Skip tmRNA detection & annotation
3
Skip rRNA detection & annotation
4
Skip ncRNA detection & annotation
5
Skip ncRNA region detection & annotation
6
Skip CRISPR array detection & annotation

  1. ¿Qué clase de archivos de salida produce Bakta, explique? Visualice el archivo FAA y cuente ¿Cuántas regiones codificantes encontró para cada muestra metagenómica?

  2. Ahora realice la clasificación funcional de los genes predichos y visualice. Para esto, utilice COGclassifier. Este software permite realizar la búsqueda de secuencias de consulta en la base de datos COG, pasando por la anotación y clasificación de las funciones de los genes, hasta la generación de figuras. ¿Qué porcentaje de secuencias fueron clasificadas? ¿Qué le indican las gráficas generadas? Adjunta las figuras y describelas.

  3. Responda a partir de los conteos de genes predichos y su anotación funcional ¿Qué diferencias observa entre las dos muestras metagenómicas? Especule sobre las posibles diferencias en la funcionalidad de la comunidad microbiana en cada una de las muestras (control y caso). Complemente su respuesta mediante la revisión del articulo de referencia2.

  1. El bono es valido al realizar ambas comparaciones.↩︎

  2. Bai, X., Narayanan, A., Nowak, P., Ray, S., Neogi, U., & Sönnerborg, A. (2021). Whole-genome metagenomic analysis of the gut microbiome in HIV-1-infected individuals on antiretroviral therapy. Frontiers in Microbiology, 12, 667718.↩︎